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如何运用脂肪干细胞在宫腔粘连

  临床上宫腔粘连患者在无症状或者无生育诉求时,通常不会选择治疗该疾病,但是当某些中重度宫腔粘连患者出现腹痛或者有强烈生育诉求时,减少子宫内膜纤维化,促进内膜生长,提高内膜容受性,改善妊娠情况就成为临床工作者努力的方向,而运用自体脂肪干细胞移植到子宫内治疗宫腔粘连从理论上而言是可行的。同时女性生育期的年龄也不会明显影响脂肪干细胞的增殖及分化能力。脂肪干细胞无论从取材便利性、操作可行性、伦理道德性来说,都是目前治疗中重度宫腔粘连,实现月经恢复正常、妊娠过程正常的最佳选择。但是目前脂肪干细胞诱导呈子宫内膜细胞尚缺乏统一、严谨、有效的试验方法,并且其中的分子机制尚不明确,有待进一步详细研究。

  目前,治疗IUA主要手段为IUA松解术联合雌激素疗法。这种疗法对轻型宫腔粘连患者有较好的疗效,但不能很好地解决重度IUA患者的内膜再生问题。转化医学的兴起为重度宫腔粘连提供了新思路,即利用细胞多向分化能力将某种干细胞诱导分化为子宫内膜细胞,修复子宫内膜形态,达到恢复月经来潮、成功妊娠的目的。国内外已有相关研究开展,故目前使用干细胞治疗或者预防宫腔粘连的实验大多处于动物实验阶段,仅有少数发展至临床试验阶段。脂肪干细胞具有取材方便,创伤小,来源丰富,规避伦理问题的特点,已有大量脂肪干细胞的转化应用研究就此开展。鉴于脂肪干细胞的提取、培养及诱导方法及相关分子机制已有相关研究,故应用脂肪干细胞治疗难治性宫腔粘连具有现实意义及可行性,故本文将对脂肪干细胞用于治疗宫腔粘连的前景进行综述。

  宫腔粘连(intrauterineadhesions,IUA)是指子宫腔内异常增生纤维组织、瘢痕组织填充的表现。子宫内膜正常的组织结构由内而外分为致密层、海绵层和基底层,宫腔粘连的发生与正常内膜组织被破坏密切相关。其中妊娠期刮宫、宫内感染、子宫多发性息肉剔除术等其他子宫内手术操作后都可能导致宫腔粘连。从而在临床上出现继发性绝经、习惯性流产等。目前,手术后给予新型透明质酸钠凝胶等可降低迟发性流产刮宫术后发生宫腔粘连的风险,治疗方法主要有超声引导下压力灌注法,IUA分离术及宫腔镜下的IUA分离术(TCRA)。

如何运用脂肪干细胞在宫腔粘连

  1宫腔粘连病理及病因

  1.1病理宫腔粘连病理表现为其中子宫内膜纤维化,即基质大部分被纤维组织和腺体所取代,被不活动的立方柱状子宫内膜上皮所取代;功能层和基底层难以区分,功能层被上皮单层取代;荷尔蒙刺激低反应和纤维化粘连并且跨腔成形。

  总之,宫腔粘连就是子宫内膜失去正常的组织结构,从而被纤维组织、单层上皮所取代。由此可与宫腔粘连病因产生联系。

  1.2病因剖宫产术后的胚胎残留物负压吸引术是宫腔粘连形成的重要危险因素;HOOKER等通过系统综述和Mete分析及临床多中心前瞻性随机试验得出流产后每五名妇女中就有一例患有IUA,其中一半以上的患者粘连的程度轻微,临床意义不明,复发性流产和妊娠期刮宫手术被确定为粘连形成的危险因素,可能与妊娠期后体内雌孕激素水平骤降子宫内膜较薄从而致内膜损伤;开腹子宫肌瘤切除术是宫内粘连形成的一个重要但目前未被重视的病因,作为开腹子宫肌瘤切除的替代治疗方法-经阴道超声引导下的射频溶解—具有令人鼓舞的疗效和安全性,提示并发症发生率低。但和DING等[12]发现了一例经阴道超声引导射频溶解后右中腔子宫壁从前面到后面形成的宫腔粘连,术后可能损伤子宫内膜基底层甚至子宫平滑肌层,后期瘢痕修复纤维增生形成粘连;盆腔放疗后造成子宫宫腔粘连的概率约为0.05%,然而,由于未来放射治疗骨盆恶性疾病的更广泛应用,这个数字可能会增加。总之,任何损伤子宫内膜到达基底层的治疗方法或者病理变化都可能导致宫腔粘连。

  2宫腔粘连的治疗与干细胞

  根据宫腔粘连的严重程度,临床症状不一,较轻的患者临床症状相应较轻甚至无明显症状,对生育能力影响不大,而中重型患者出现继发性绝经、反复流产等,对于有生育诉求的患者来说,是导致不孕的重要因素。因此,从最初源头上预防宫腔粘连、治疗改善内膜粘连状况,恢复子宫内膜正常月经来潮周期及胚胎着床发育条件是越来越多医学工作者面临的难题。超声引导下压力灌注法(pressurelavageunderultrasoundguidance,PLUG),TCRA及宫腔镜下的TCRA等外科治疗方法是目前常用的治疗方法,预防宫腔粘连方面有研究证明术后透皮雌激素凝胶和口服阿司匹林联合治疗可能通过增加子宫血和血管生成来增强子宫内膜容受性,从而有助于改善生育预后[13]。另目前CAI等[14]基于结合了人造生物相容性材料GelMA和天然多糖材料海藻酸钠特征的微流体液滴模板的新型载药多孔支架,获得了符合子宫腔形状的多孔支架,并且在宫腔粘连的大鼠模型中测试了该系统,证明该系统具有促进新血管形成,使受损组织细胞化和修复子宫内膜的能力。但是这些方法对于恢复子宫内膜正常结构意义不明显[15-16]。故干细胞的多向分化潜能为重建子宫内膜正常结构提供了可能。目前,多种干细胞用于子宫内膜再生的研究,如CAO等[5]运用脐带间充质干细胞进行胶原支架治疗复发性子宫粘连患者的同种异体细胞疗法提示经过脐带间充质干细胞移植治疗宫腔粘连后,子宫内膜重新获得增殖与再生能力;JU等将小鼠骨髓干细胞移植到宫腔粘连小鼠动物模型中,发现模型小鼠中子宫内膜腺体的数量并降低了纤维化面积率,同时雌激素受体与孕激素受体表达水平上调,并且得出骨髓干细胞移植到宫腔粘连模型中可能通过促进ER和PR表达来有效修复受损的子宫内膜;CABANILLAS等[7]运用来自体外周血CD133+骨髓来源干细胞通过导管插入立即输入子宫螺旋动脉中治疗宫腔粘连及子宫内膜萎缩患者。2个月后,所有患者内膜厚度增加,前3个月成熟血管密度增加和月经的持续时间和强度较治疗前改善,此外,还妊娠方面结果也有一定改善。目前,使用干细胞治疗或者预防宫腔粘连的实验大多处于动物实验阶段,仅有少数发展至临床试验阶段,动物实验结论如何运用至人体实验,且如何优化临床试验方式,从而提高患者月经正常、妊娠成功比例是未来科研努力的方向。在目前进行的干细胞治疗宫腔粘连的研究中,干细胞移植到宫腔后,分泌抗纤维化细胞因子可以改善宫腔内粘连情况,对于子宫内膜修复意义深远,表明运用干细胞治疗宫腔粘连具有可行性;在干细胞的选择上,应尽量选择与子宫内膜细胞相同胚胎来源的干细胞种类,如同来源于中胚层的骨髓间充质干细胞,但是由于骨髓穿刺术获取骨髓干细胞的方式相对获取的骨髓干细胞数量有限,而脂肪干细胞属于间充质干细胞的一种,同样来源于中胚层,从体内获取方便且数量丰富,与此同时,也有将脂肪干细胞运用于骨再生、周围神经再生等方面的研究,对于其获取、培养、诱导等方面有一定的经验可以借鉴,故而将脂肪干细胞运用于宫腔粘连治疗具有可行性与创新性。

  3脂肪干细胞

  3.1概述脂肪干细胞(adiposederivedstemcells,AD⁃SCs)属于成体干细胞,是一种间充质干细胞,胚胎来源为中胚层,在人体组织中主要分布在脂肪组织中,ADSCs的典型或者特异性细胞标记为:CD90(+)、CD73(+)、CD105(+),同时CD45(-)、CD34(-)。在细胞治疗及组织工程中脂肪干细胞是最有优势的成体干细胞[18],原因有如下几点:

  (1)脂肪干细胞来源丰富,取材方便。皮下脂肪丰富,并且可在行抽脂术的同时留取作为副产品的脂肪组织,且对机体损伤小,与此同时可分离得到充足的脂肪干细胞,从同样重量的脂肪和骨髓中分离到的干细胞数量,脂肪干细胞约为骨髓干细胞的500倍;

  (2)增殖能力强于骨髓间充质干细胞,生长因子分泌能力及免疫能力强于其他干细胞,如血管内皮生长因子-D(vascularendothelialgrowthfactor⁃D,VEGF⁃D),胰岛素样生长因子(insulin⁃likegrowthfactor⁃1,IGF⁃1)及白介素-8(interleukin⁃8,IL⁃8);

  (3)脂肪干细胞可从患者自身取材,同时避免异体细胞,胚胎干细胞治疗伦理问题。

  3.2ADSCs的获取、分离及培养脂肪干细胞的提取在已经有很多尝试,目前国际上公认的简便、有效、经济的提取方式为脂肪抽吸术,此时选择合适的供体部位至关重要,有研究表明供体不同部位的脂肪干细胞活力概况差别不大,但就相同体积分离得到的脂肪干细胞产量而言,大腿外侧明显高于腹部、腰部和膝盖经研究了供体年龄对ASCs增殖潜能和分化多能性的内部;与此同时,研究者还发现新鲜提取的脂肪干细胞与经过培养后的脂肪干细胞在细胞表型及细胞动力学检测表现出微小差异,因此得出两种脂肪干细胞可能表现出相同的生存能力[17]。另外通常认为脂肪干细胞的功能随着年龄而下降,尽管一些研究已研究了供体年龄对脂肪干细胞增殖潜能和多能性的影响,但这些研究的结果并不一致。HASEGAWA等的研究分析表明,脂肪形成潜能随着年龄的增长而下降,但细胞增殖能力、成骨和软骨形成潜能与年龄无关,并且在包括脂肪生成在内的所有脂肪干细胞分化潜能中,观察到个体差异,主成分分析(PCA)显示,老年人的个体差异变得明显(60岁以上),这些变异在女性中比在男性中更为突出(女性超过60岁,男性超过80岁)。从获取的脂肪组织中分理处脂肪干细胞的具体方法大致如下,如BACAKOVA等可通过脂肪抽吸术获得脂肪干细胞,获得的脂肪组织在经过磷酸盐缓冲盐水的反复漂洗至缓冲盐水干净后,再将其切碎呈约0.3cm×0.3cm颗粒状;将标本转移至添加0.75%Ⅰ型胶原酶的磷酸盐缓冲盐水中,在37℃环境中静放60min;然后再以800r/min速度离心5min,离心后,上清液为脂肪细胞悬液,沉淀为脂肪源性基质血管部分。然后弃去上清液,保留沉淀部分。沉淀部分包含有多种细胞,如内皮细胞、免疫细胞、平滑肌细胞、干细胞和其他基质细胞。接下来将沉淀部分在此悬浮于磷酸盐缓冲盐水中再利用80μm尼龙筛网过滤,分离组织碎片,然后以8000r/min速度离心10min。保留离心后的细胞悬液,并将细胞悬液加入添加了10%胎牛血清、40μg/mL浓度的庆大霉素和5ng/mL浓度的成纤维细胞生长因子的DMEM(dulbecco'smodifiedeagle'sminimumessentialmedium)培养基中,再将培养基放置在温度为37℃,5%CO2环境中。待细胞长满培养基约80%面积时,加入含有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(EDTA)磷酸盐缓冲盐溶液5min[18]。其某些细节有差别,如ROXBURGH等在研究中采用的Ⅰ型胶原蛋白酶浓度为0.075%,获得脂肪源性基质血管部分时的离心速度为2000r/min。在ADSCs培养过程中培养基的选择各个实验室也均有不同,但是其中基础培养基的是10%胎牛血清,另生长因子可以影响ASCs的未分化状态,故在体外条件下,干细胞表型可能受到生长培养基类型,培养基特定补充物及生长环境条件的影响。

  还有研究表明细胞培养中常用的抗生素的存在对ADSC的表型不是完全中性的,它们有调节分化过程的作用[24]。因此在常规细胞培养过程中添加抗生素中医防止培养基被污染的步骤需要谨慎选择是否添加入脂肪干细胞培养基中。根据其分化方向所采用的培养基会有所差别,但目前诸多研究报告得出富含血小板PRP[25]能明显促进脂肪来源干细胞生长及增殖,增强其成脂活性及能力,但是其具体机制尚不明确[26]。上述的脂肪干细胞提取、分离、培养方法均为体外实验的方法,而且在每个过程中都有可能会影响脂肪干细胞的增殖和分化能力,从供体年龄、供体部位到培养基选择、培养环境等,因此,在此步骤中应当在标准操作基础上进一步根据相关的实验目的来选择适合适的方法。脂肪干细胞在经过分离、培养后可以正常生长,但是在后续的实验过程中,如何长期保持其增殖及分化能力,在经过长期的传代培养过程中,可能出现的细胞衰老凋亡现象该如何避免呢,根据相应的实验目的,到底是选择新鲜分离得到的脂肪干细胞还是经过培养后的干细胞,这些问题在研究过程中都应该经过严谨的实验设计来验证解决。

  3.3ADSCs的增殖与分化脂肪干细胞是一种成体干细胞,保留了增殖能力及多向分化潜能,脂肪干细胞可通过相应的诱导因素分化成成骨细胞、血管平滑肌细胞、骨骼肌样细胞及神经施旺细胞,其具体机制不明确,诱导因素如何确定,主要与诱导方向细胞的体内周围环境有关,通过调整培养基硬度、培养基添加细胞因子种类、物理刺激类型(电刺激、微波刺激、超声波刺激)来创造合适的诱导条件。在体内实验中,脂肪干细胞移植到动物模型中的方法大概有3种,静脉注射、原位移植或复合胶原支架材料等,其中干细胞与胶原支架是再生医学的重要两元素,胶原支架可以为干细胞提供三维的空间,利于干细胞的迁移和生长,而不影响干细胞的干性相关基因的表达。

  此外,在生物工程方面,WANG等开发了一种生物工程三维膀胱贴片,由多孔支架和多层脂肪干细胞片组成,并在膀胱损伤的大鼠模型中发现此贴片可促进尿路上皮再生,平滑肌、神经细胞和膀胱血管再生。目前,脂肪干细胞用于治疗或者预防宫腔粘连的研究文献有限,其中在孔德胜的研究中将体外培养的绿色荧光蛋白转基因(GFP⁃ASCs)大鼠来源的脂肪间充质干细胞通过原位移植或复合小肠黏膜下基质(SIS)等方式移植,观察子宫膜修复的病理形态学变化、容受性改善及GFP⁃ASCs对修复的影响SIS复合或不复合ASCs移植后,均可明显改善子宫内膜病理形态学指标,减少纤维化,促进内膜生长,提高内膜容受性,改善妊娠情况,但以SIS复合ASCs效果更佳。SUN等运用大鼠脂肪干细胞移植到大鼠子宫内,一些脂肪干细胞在子宫内直接分化成具有新生血管生成的子宫内膜基质细胞,而其他表达雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)并在后续妊娠中胚胎能够成功着床在移植宫角部位。可进一步验证小鼠是否能够成功受孕并生产,同时设立对照组,排除其他干扰因素。

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