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胆管上皮细胞促进肝损伤再生

  胆管上皮细胞(BEC)在肝脏中形成胆管,并且是兼性肝干细胞,其建立导管反应以支持损伤后的肝脏再生。肝损伤诱导可形成BEC样器官的门静脉LGR5 +假定的肝干细胞,表明RSPO-LGR4 / 5介导的WNT/β-连环蛋白活性对糖尿病视网膜病变很重要。我们通过在BEC样器官中进行基于CRISPR的功能缺失筛查,然后进行体内研究,探讨了该信号通路和其他信号通路在糖尿病视网膜病变中的作用。验证和单细胞核糖核酸测序。我们发现BEC在糖尿病视网膜病变过程中存在缺陷,不需要LGR4/5介导的WNT/[β-连环蛋白信号,这需要YAP和mTORC1信号。肝细胞中AXIN2和LGR5需要上调,以使它们能够在损伤后再生。总之,这些数据突出了BEC文库的异质性,描述了灾难恢复中涉及的信号通路,并阐明了损伤诱导的门静脉LGR5+细胞的身份和作用。

胆管上皮细胞促进肝损伤再生

  介绍

  与组成型活性组织干细胞龛的高细胞周转率器官相比,肝脏利用兼性干细胞促进按需再生(宫岛等人,2014年,杨二和斯坦格,2011年)。整个肝小叶中的肝细胞可以通过重新进入细胞周期和替换肝细胞而充当兼性干细胞(米查洛普洛斯和德费兰斯,1997年,普拉纳斯-帕斯等人,2016年,杨二等人,2014年)。此外,它们被转化为胆汁上皮细胞(BEC,也称为胆汁细胞)以应对肝脏损伤(塔尔洛等人,2014年,杨二等人,2013年),并能够再生胆汁系统(米查洛普洛斯等人,2005年,沙布等人,2018年)。BEC形成负责胆汁排泄的胆管和收集胆汁的外周小管和海林管。受伤后,激活的BEC在门静脉周围扩张,形成短暂的腔上皮,并在称为导管插入术的过程中建立辅助胆管系统(Kamimoto等人,2016年,Roskams等人,2004年)。除了能够形成排出肝毒性胆汁的辅助导管之外,BEC还能够分化成功能性肝细胞以支持肝再生,因此被认为是兼性肝干细胞(2018年,Raven等人,2017年,Rodrigo-Torres等人,2014年,Russell等人,2018年,Shin等人,2015年)。尽管有生理上的相关性,调节BEC激活和扩展以建立灾难恢复的机制还没有被完全理解。

  BEC样器官(BEC样器官)在体外扩张,具有管腔上皮和BEC特征,类似于在灾难恢复期间形成导管结构的BEC,来源于损伤后出现的LGR5+肝细胞(2018,Huch等)。),2013年)。Lgr5最初被鉴定为WNT/β-连环蛋白靶基因和高增殖性肠干细胞的标记物(Barker等人,2007年,并在几个组织干细胞龛中表达,这些龛需要R-Sprin(RSPO)-lgr 4/5介导的WNT/β-连环蛋白信号传导来实现器官稳态和修复(Clevers等人,2014年)。在健康肝脏中,LGR5标记有具有高WNT/β-连环蛋白活性的静止的中央周围肝细胞。(Planas-Paz等人,2016年)。一个关键的问题涉及在灾难恢复过程中门静脉分泌物在LGR5 +假定肝干细胞启动中的可识别身份和作用(Huch等人,2013年),RSPO-LGR4 / 5介导了WNT/β-连环蛋白信号对这一过程的贡献。

  我们对小鼠BEC样器官进行了CRISPR-Cas9功能丧失(LOF)筛查,以确定体外调节BEC扩张的信号通路。此外,我们使用几个灾难恢复诱导的肝损伤模型验证了这些途径在体内的必要性。结合EPCAM + BEC,WNT/β-连环蛋白报道了小鼠单细胞核糖核酸测序(scRNA-seq)、谱系追踪和原位杂交(ISH),我们进一步提供了调节糖尿病视网膜病变机制的单细胞和空间分辨率。最后,我们阐明了门静脉LGR5 +细胞的细胞特征和作用。

  结果

  BEC-有机类CRISPR LOF筛选识别体外调节BEC生长的途径

  建立灾难恢复的最常见机制是延长BEC(Kaimoto等人,2016年)。为了确定调节BEC样器官生长和形成的途径,我们在BEC样器官中进行了基于CRISPR-Cas9的联合LOF筛选,该器官来自表达Cas9 ( A)的Rosa26基因座(R26-SpCas9小鼠)的小鼠肝脏。这些BEC样器官是EPCA+/SOX9+,其胆汁基因特征类似于之前从LGR5 +小鼠肝细胞(Huch等人,2013年)或EPCA+人肝细胞(Huch等人,2015年)中分离的BEC样器官。图S1A和S1B)。对于稳定表达Ca9的R26-SpCa9 BEC样器官,我们实现了高效的慢病毒递送(图S1C和S1D)和高Ca9编辑效率(98%) (B)。使用慢病毒导向核糖核酸(gRNA)文库筛选获得率,文库中有超过5000万个独特的非靶向条形码序列,这表明BEC样器官中文库的代表性缺失随着时间的推移而扩大(图S1),表明只有一小部分分离的BEC样器官细胞产生新的器官样物质。然后,我们设计了一个脱氧核糖核酸条形码来设计一个定制的慢病毒CRISPR文库,每个基因平均有5个γ核糖核酸,包括192个涉及肝再生的假设(涉及肝发育、细胞周期、肝癌和组织体内平衡的基因);表S1)和阳性(核心必需基因)和阴性(嗅觉基因和非靶向gRNA)对照。我们通过经验比较由51个基因组成的CRISPR筛选文库子集的gRNA计数的可重复性,比较了可重复性汇集所需的gRNA表达,表明需要10,000个细胞/gRNA。来补偿随机损失。分裂步骤中的BEC样器官细胞。因此,CRISPR文库被递送到R26-SpCas9 BEC类器官单细胞,代表每gRNA 10,000个细胞,并且gRNA转导的BEC样器官在培养12天后被条形码测序。条形码表达不足或过度对应于分别增强或抑制BEC样器官生长的基因(D)。所有gRNAs都存在于所有下一代测序(NGS)样品中,第12天的样品略低于总库,因为核心必需控制基因(例如,Copa、Spc25、Eif3a、Plk1、Prpf8和Gtpbp4)。据报道,它对细胞适应和增殖至关重要(Hart等人,2015年;和S2·S2D)。相对于转录因子而言,gRNAs代表不足的Sox9和Hnf1β表明,它们不仅在发育过程中需要胆汁分化(Lemaigre,2009),还需要体外BEC样器官生长。相比之下,常见的BEC标记,如Krt7、Epcam、Cd24a、Prom1和Aqp1,不影响BEC样器官的生长。Yap1是胆管癌肝细胞生长和癌基因的关键介质(Camargo等人,2007年Marti等人,2015年;mTOR 1(mTOR和Raptor))已被证明是BEC级器官生长所必需的。此外,由于gRNA变异性不同,gRNA针对β-连环蛋白的代表性不足,尽管不显著。几个靶向河马复合体的GRnas(Piccolo等人,2014,2011)对YAP活性(Sav1和Lats1)的过表达进行了负调节,进一步证明了YAP-河马途径在控制BEC样器官生长中的重要性。在胆管癌患者中也观察到SAV1突变(Sia等人,2013年)。人胆管癌具有多种肿瘤抑制活性。这些基因(Trp53、Cdkn2b、Cdkn2a、Cdkn1a和Pten) (Sia等人,2013年)是我们筛选中发现的顶级BEC级器官生长抑制基因之一,表明它们在限制BEC生长以防止肝肿瘤形成方面的重要性。此外,Apc是β-连环蛋白破坏复合物的核心成分,也是WNT/β-连环蛋白信号的抑制剂(Stamos和Weis,2013年),Znrf3和Rnf43,两者都是通过调节卷曲蛋白周转来抑制WNT/β-连环蛋白信号的(Hao等人,2012年,Koo等人,2012年),限制BEC样器官的生长(D)。有趣的是,RNF43也在人胆管癌中发现。突变(Ong等人,2012年)。尽管Map2k4 (Wuestefeld等人,2013年)和Foxa3 (Wangensteen等人,2015年)都被鉴定为体内肝细胞再生的负调节因子,但只有Map2k4缺失促进了BEC样器官的生长。屏幕的高重复性(R = 0.949),误报命中率为5%,误报命中率为0%,表明对所识别的命中有很强的置信度(图S2E-S2G)。总之,我们的CRISPR LOF筛查突出了WNT/β-连环蛋白、mTORC1和YAP信号以及其他调节体外BEC样器官扩张的关键途径。

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